图 定点修饰Cas12a共价偶连crRNA提高Cas12a系统基因组编辑效率
在国家自然科学基金项目（批准号：91853111、21922701）资助下，北京大学药学院刘涛课题组，利用非天然氨基酸定点修饰技术，通过蛋白核酸复合物的定点共价偶联，构建了高效Cas12a基因编辑系统。该研究成果以“定点修饰Cas12a-crRNA共价复合物提高CRISPR/Cas12a系统编辑活性（Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates）”为题，于2021年10月13号发表在《分子细胞》（Molecular Cell）期刊。论文链接：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(21)00773-5
Cas12a相比Cas9更加安全，但受限于编辑效率低下的影响，较难应用于临床治疗。CRISPR编辑系统由蛋白质和核酸两个部分组成：核酸酶Cas蛋白负责切割基因组DNA，向导RNA（crRNA）则通过碱基互补配对的方式引导核酸酶到指定基因组位点进行切割。研究团队利用非天然氨基酸定点修饰技术，在Cas12a核酸酶上合适位点特异性引入了含有叠氮基团的非天然氨基酸，该修饰并不会影响Cas12a的活性与物理化学性质，且可以与5’端修饰DBCO的crRNA共价偶连，通过生物正交反应实现Cas12a与crRNA的蛋白质核酸共价偶联，从而将基因编辑中Cas12a、crRNA与基因组DNA之间的三分子反应转化为两分子反应，显著的提高了Cas12a系统的基因编辑效率，且不会额外引发脱靶。并在此基础上，研究团队将该技术应用于定点整合CAR-T细胞的高效制备（如图），有望推动新一代免疫细胞的更安全可控制备技术，同时也为Cas12a系统的广泛应用奠定了基础，并为其他低效的Cas核酸酶改造提供了思路与方法。