北京时间2024年1月26日凌晨3时，国际顶级学术期刊《科学（Science）》在线发表了基因组所（省实验室深圳分中心）闫建斌研究员与北京大学雷晓光教授等合作完成的最新研究成果：“Characterization and heterologous reconstitution of Taxus biosynthetic enzymes leading to baccatin III（巴卡亭III生物合成酶的鉴定与异源重构）”，研究发现了紫杉醇生物合成途径中的两个缺失的关键酶“T9αH”“TOT”，阐明了关键结构分子—紫杉烷氧杂环丁烷的形成机制，打通了紫杉醇生物合成途径。该研究成果标志着我国在紫杉醇合成生物学理论和技术上站在了世界领先地位。

　　目前，我国紫杉醇原料药主要通过从人工种植的红豆杉植物提取紫杉醇前体结合化学半合成方法获得，这种方式高度依赖红豆杉资源，成本高，产量低，很难满足我国日益严峻的癌症防控需要，还可能引发生态破坏和耕地占用等诸多问题。

　　如何不依赖红豆杉，实现紫杉醇的生物合成？

　　是摆在全世界科学家面前的一个难题。

　　自上世纪80年代起，科学家便开始寻找一种可以替代天然提取紫杉醇的合成方法，1990年，美国率先研发出一条紫杉醇半合成路线，并迅速投入商业化生产，在此后的30余年内，全球上百个科研团队相继投入到紫杉醇的生物全合成研究中，但均未能实现突破。

　　经过多年的探索，基因组所（省实验室深圳分中心）研究团队领衔解决了这一世界级难题，找到了一条无需消耗天然红豆杉资源、不依赖土壤种植的绿色可持续生产方法。

　　紫杉醇的生物合成

　　紫杉醇的生物合成途径高度复杂，涉及羟化、酰化、环氧化等多个生化反应和19个合成关键酶。

　　想要实现紫杉醇在异源系统中的生物合成，需要突破三个难点。

　　一是找到紫杉醇关键生物合成酶。

　　二是解析关键合成酶的催化机制。

　　三是设计线路实现异源生物合成。

　　找到“缺失的”酶

　　自紫杉醇发现以来的半个世纪里，绝大多数紫杉醇合成相关基因均由欧美研究团队主导完成。最先进的紫杉醇提取技术、核心的红豆杉细胞生产技术和基因工程技术等，依然牢牢掌控在欧美制药公司的手中，如美国的百时美施贵宝制药公司，法国的赛诺菲公司，德国Phyton公司等。

　　突破之路，始于首张南方红豆杉基因组蓝图。

　　2021年，闫建斌团队领衔绘制国际首张染色体级别的南方红豆杉高质量参考基因组图谱，揭示了红豆杉合成抗癌药物紫杉醇的遗传基础，为紫杉醇生物合成途径的解析提供了基因组学蓝图和关键候选基因。相关研究成果以封面文章形式发表在《自然植物（Nature Plants）》上。

　　在此基础上，研究团队进一步对58个紫杉醇生物合成关键候选基因进行筛选，成功发现了能够催化氧杂环丁烷环合成的细胞色素P450酶，命名为TOT1（紫杉烷氧杂环丁烷合酶，Taxane Oxetanase 1）（图1），研究发现，该基因能够显著降低巴卡亭III和紫杉醇的生物合成。

图1 紫杉烷氧杂环丁烷合酶的筛选与鉴定

　　由于难以分离C9位未被氧化的中间体，在过去三十年中科研人员始终未能鉴定催化紫杉烷C9氧化的酶。为突破这一难题，研究团队创造性地构建了紫杉素的生物合成植物底盘，利用该底盘和生物信息学分析，从17个候选基因中筛选出了负责紫杉烷 C9 位氧化的酶T9αH1（Taxane 9α hydroxylase 1）（图2）。该基因位于红豆杉的9号染色体上，介于T2αH和T7βH两个已知的紫杉醇合成基因之间。

图2 紫杉烷C9氧化酶的筛选与鉴定

　　解析催化机制

　　传统观点认为，紫杉醇氧杂环丁烷的形成涉及两步过程：首先，4(20)-烯-5α-乙酸酯结构被环氧化，生成 4(20)β-环氧-5α-乙酰氧基三元环中间体（称为环氧化物环），然后通过重排反应从环氧化物扩展为氧杂环丁烷。也就是说，环氧化物的形成是生成氧杂环丁烷的先决条件。然而，本研究发现TOT1并不能催化三元环中间体向四元环的转变，而是将双键结构同时转变为三元环和四元环结构，从而证明了环氧化物不是氧杂环丁烷形成的必要中间体。

　　通过密度泛函理论（DFT）计算与酶的底物选择性检测，研究者们进一步揭示了环氧化物和氧杂环丁烷都可以通过 TOT1 酶中的羰基离子中间体（Int1）产生，但氧杂环丁烷产物的生成在能量和动力学上都比环氧化物更有利，解释了氧杂环丁烷为优势产物的分子机制。这一研究结果，颠覆了30年来人类对于该结构生成机制的传统认知，填补了仅在植物界中存在的环扩张反应生成含氧四元环结构的分子机制的缺失。

　　设计和异源重建合成路线

　　在解决了关键酶缺失的问题后，研究人员利用人工异源合成途径构建策略，将新鉴定得到的酶与已知合成酶进行组合，通过多次尝试，成功在植物底盘中生成了巴卡亭III。该合成路线仅需9个关键生物合成酶（TOT1、T9αH1、TXS、T5αH、T13αH、T2αH、T7βH、TAT、TBT），进一步研究显示，这些核心基因受到植物激素茉莉素的共表达调控，具有相似的诱导表达模式和显著的表达相关性，说明这些基因在细胞中受到密切的协同调控。结合亚细胞定位分析等实验结果，该研究绘制出了巴卡亭III的完整生物合成过程：

　　1、起始底物GGPP在叶绿体中被TXS酶催化形成紫杉二烯。

　　2、紫杉二烯通过质体-内质网的接触点转移到细胞质之后，受到内质网锚定的六个氧化酶（T2αH、T5αH、T7βH、T9αH、T13αH 和 TOT）与两个细胞质定位的酰基转移酶（TAT和TBT）的协同催化，生成巴卡亭III。

　　该研究成功发现了紫杉醇生物合成途径中最具挑战的未知酶，阐明了颠覆传统认知的植物含氧四元环结构的形成机制，建立了紫杉醇生产前体巴卡亭III的异源生物合成路线，相关研究成果已申请或获得多项专利，为中国紫杉醇绿色制造产业化铺平了道路。

　　中国农业科学院深圳农业基因组研究所（岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心）为第一单位。基因组所闫建斌研究员和北京大学雷晓光教授为论文的共同通讯作者，基因组所硕士毕业生蒋彬、北京大学高磊特聘副研究员和博士研究生王海军、基因组所博士研究生孙亚平为该论文的共同第一作者。

　　该研究得到了中华人民共和国科学技术部、国家自然科学基金委员会、美国国立卫生研究院、中国农业科学院、北京分子科学国家实验室、北大-清华生命科学联合研究中心、广东省、北京市、深圳市及大鹏新区的资助。项目资助的第一标注为合成生物学国家重点研发计划。