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虾类免疫机制研究取得新进展

生命科学部 胡景杰 任红艳

  我国是世界对虾养殖第一大国。随着养殖规模的扩大及养殖环境的恶化,对虾病害严重,给养殖业造成严重损失。研究对虾等甲壳类动物的免疫反应,对预防和控制病毒性疾病有重要的意义。在国家自然科学基金重点项目(31130056)和面上项目(30770282,30728001,30972236)等资助下,山东大学王金星教授课题组在虾类模式识别受体的功能及抗病毒免疫机理方面,开展了较为深入的研究工作,相关成果发表于Journal of Immunology、Journal of Virology和Journal of Biological Chemistry等杂志上。

  1. C-型凝集素免疫功能的多样性

  C型凝集素(C-Type Lectin)是一种重要的模式识别分子,在免疫识别和免疫激活中发挥关键作用。C-型凝集素能与钙网蛋白相互作用促进病毒感染:通过口服感染白斑综合征病毒(WSSV),在日本囊对虾胃中鉴定到一种C型凝集素分子,命名为MjsvCL(M. japonicus stomach virus-associated CL)。当病毒感染时,MjsvCL在胃中显著上调表达;利用RNA干扰的方法敲降MjsvCL的表达,对虾体内病毒的复制受到抑制;“过表达MjsvCL”则促进病毒在对虾体内的复制。研究表明,MjsvCL可以与WSSV的囊膜蛋白VP28相互作用;另外,MjsvCL可以与细胞表面的钙网蛋白(CRT)相互作用,促进病毒的感染与复制。因此,作为病毒粒子与CRT之间的桥梁,MjsvCL可识别WSSV的囊膜蛋白VP28,并被CRT捕获。三者形成复合体后,病毒以一种胆固醇依赖的方式内吞入胞,促进感染。C-型凝集素与整联蛋白相互作用促进血细胞的吞噬作用:课题组研究发现中国明对虾的1种C-型凝集素(FcLec4)可以与多种细菌结合,发挥调理素的功能,促进机体对入侵细菌的清除。研究还发现了在日本囊对虾中也存在同源分子。凝集素FcLec4分布于血细胞的表面,在对虾免疫防御反应中,FcLec4的C-端识别入侵的病原,N-端与宿主血细胞膜上的整联蛋白b结合,促进对虾血细胞对细菌的吞噬作用。C-型凝集素通过调节抗菌肽的表达抑制对虾血淋巴中的微生物群落:研究发现了1种在日本囊对虾血细胞中组成性高表达的C-型凝集素(MjHeCL),具有广谱的病原细菌识别能力。病原菌感染对MjHeCL的表达没有影响;通过RNA干扰沉默其表达,对虾中多种抗菌肽如抗脂多糖因子和对虾素等受到了明显的抑制,引起血淋巴中细菌增殖失控,导致对虾死亡;通过注射重组的MjHeCL可以使MjHeCL沉默对虾恢复到健康状态。因此,MjHeCL在对虾免疫内稳态中起关键作用。

  2. 泛素化与类泛素化在对虾抗病毒免疫中的功能

  泛素结合酶E2介导WSSV含有RING结构域蛋白的泛素化,并抑制病毒的复制:课题组从中国明对虾中克隆得到了一个泛素结合酶E2,命名为FcUbc。FcUbc特异性的分布于对虾肝胰腺和小肠中,在受到WSSV刺激后,呈现出上调表达的趋势。利用FcUbc重组蛋白注射对虾,可明显降低染毒对虾的死亡率。实验证实FcUbc可以结合病毒的4个含有RING 结构域的蛋白,同时介导了WSSV277和WSSV304的RING结构域蛋白的泛素化,最终抑制病毒的复制。SUMO结合酶介导WSSV极早期蛋白的SUMO化修饰并最终促进病毒复制:在克氏原螯虾中鉴定到了小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier, SUMO)和SUMO结合酶UBC9。UBC9和SUMO分布于克氏原螯虾各组织,WSSV刺激后呈现上调表达,注射UBC9 或SUMO重组蛋白可增强WSSV的复制。实验表明UBC9蛋白体外结合WSSV 三种极早期蛋白(WSV051,WSV069和WSV187),其中WSV051能够被宿主UBC9介导发生SUMO化修饰。利用RNA干扰降低UBC9或SUMO的表达水平,导致病毒晚期基因表达被抑制,极早期基因表达也受到影响而表达量降低;注射的重组UBC9或SUMO可以解除抑制作用,使感染的WSSV 基因表达恢复正常状态。因此,克氏原螯虾SUMO化系统被WSSV所“绑架”而用来修饰自身的极早期IE蛋白,促进了病毒基因的转录和病毒复制。

  3. RNA干扰途径在对虾中的抗病毒功能

  转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP) 是一种多功能蛋白,中国明对虾中TRBP和转录起始因子6(eIF6)可以相互作用,参与对虾的抗病毒免疫。课题组在日本囊对虾中发现了3个TRBP基因和1个eIF6基因。TRBP编码的蛋白具有3个双链RNA结合结构域,结构域B和C介导与eIF6的结合。TRBP结构域A对dsRNA具有很高的亲和力,而结构域B亲和力弱,结构域C不结合dsRNA,但可通过介导TRBP全长分子的二聚化提高TRBP分子的亲和力。研究表明,TRBP和eIF6参与dsRNA介导的RNA沉默,沉默TRBP和eIF6均可影响对虾的RNAi的效果,促进WSSV的增殖。

  4. 克氏原螯虾抑制素参与抗病毒免疫的研究

  抑制素(Prohibitins, PHBs)在甲壳动物免疫中的功能报道还很少。在克氏原螯虾中鉴定出一种抑制素,命名为PcPHB1,在克氏原螯虾各组织中广泛表达,WSSV刺激后其在核酸水平和蛋白水平的表达量都有明显的提高。在病毒刺激下,与对照组相比PHB1重组蛋白能够明显的降低克氏原螯虾的死亡率。用RNA干扰的方法敲降PHB1的表达,并感染WSSV后,克氏原螯虾的死亡率明显增加。拯救实验表明,PHB1重组蛋白能够减少克氏原螯虾的死亡率。研究表明,PHB1可能通过与病毒囊膜蛋白VP28,VP26和VP24的相互作用,抑制病毒的侵染和病毒感染后病毒的组装。

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